YY/T 0127. 10-2001 口腔材料生物學(xué)評價 第2單元:口腔材料生物試驗(yàn)方法鼠傷寒沙門氏桿菌回復(fù)突變試驗(yàn)(Ames試驗(yàn))
YY/T 0127. 10-2001.Biological evaluation of dental materials-Part 2:Biological evaluation test method of dental materials-Salmonella typhimurium reverse mutation assay (Ames mutagenicity test).
5.3增菌培養(yǎng)
從冷凍貯存菌株管中刮取細(xì)菌置5 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,經(jīng)37C振蕩(100次/min)培養(yǎng)10~12h,活菌數(shù)應(yīng)達(dá)10°個/mL(或ODos≈0.4)。細(xì)菌培養(yǎng)液從37C取出后,應(yīng)立即放人冰浴中備用。試驗(yàn)需用當(dāng)天孵育好的新鮮細(xì)菌。
5.4菌株鑒定
5.4.1組氦酸需求(his- )試驗(yàn)
凡組氨酸營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌株只能在補(bǔ)充組氨酸的培養(yǎng)基上生長,而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上不能生長。
鑒定方法:在底層培養(yǎng)基平m表面加入0.5 m mol/L L-組氨酸0.1 mL和0.5 m mol/L D-生物素0.1mL.用L.棒鋪開。對照平皿只加生物素不加組氨酸。用白金耳浸細(xì)菌培養(yǎng)液,在對照平皿和含有組氨酸/生物素的平皿表面分別平行劃線。四株細(xì)菌可劃在同一個平皿上,經(jīng)37C孵育24 h后,觀察細(xì)菌生長情況。試驗(yàn)菌株在含組氨酸平皿上生長,在對照平皿上不應(yīng)生長。
5.4.2脂多糖屏蹄缺陷鑒定(rfa突變)
粗糙型突變的微生物,其細(xì)胞表面一層脂多糖屏障已經(jīng)破壞,因此一些大分子物質(zhì)能穿過菌膜進(jìn)人.菌體內(nèi)而抑制其生長。野生型茵株或含gal缺失的菌株則不受影響。鑒定方法:分別將每種細(xì)菌培養(yǎng)液0.1 mL加到45C 2 mL頂層培養(yǎng)基試管內(nèi),混勻后傾倒于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿表面,使其均勻分布。待固化后,取直徑為6mm無菌濾紙圓片浸1mg/mL結(jié)晶紫溶液10pL,放到平皿中央。經(jīng)37C孵育24h后,圍繞四紙片出現(xiàn)透明的抑菌環(huán)(直徑大約14mm),說明此菌存在深粗型(rfa)突變。TA 97.TA 98.TA 100、TA 102均有抑菌環(huán)。野生型鼠傷寒桿菌無抑菌環(huán)。
5.4.3對紫外線敏感性鑒定(uvrB修復(fù)缺陷型的容定)
具有uvrB修復(fù)缺陷型的試驗(yàn)菌株,在紫外線照射后仍能照常生長,借此證明uvrB突變的存在。鑒定方法:用白金耳沒細(xì)菌培養(yǎng)液,在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿表面平行劃線,四株細(xì)菌可劃在同一平皿上。用黑紙覆蓋平皿一半,在距離33cm處用15 W紫外線殺菌燈照射平皿8s.經(jīng)37C孵育24h后觀察結(jié)果。對紫外線墩感的園株(TA 97.TA 98,TA 100)只在未照射過的一半平皿上生長。而具有uvrB .修復(fù)缺陷型的菌株(TA102)在紫外線照射(未蓋黑紙的另一半平皿)后仍能生長。
5.4.4抗氨芐 青霜索(PKM101)試驗(yàn)(菌株R因子丟失鑒定)
含R因子的試驗(yàn)菌株對氨芐青霍索具有抗性。R因子不穩(wěn)定容易丟失，從而使試驗(yàn)菌株喪失R因子的特性,故需鑒定R因子是否存在.
鑒定方法1:用白金耳沒細(xì)菌培養(yǎng)液,在含氨芐青霉索平皿表面平行劃線,四株細(xì)菌可劃在同-平皿上。還應(yīng)選用一個無抗性因子的蘭株。以測定氦芐青霉素的效應(yīng)。經(jīng)37C孵育24h后,無抗性因子菌株不應(yīng)生長。
鑒定方法2:用白金耳沒細(xì)菌培養(yǎng)液，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿表面平行劃線,四株細(xì)菌可劃在同一平皿上。將沾有氦芐青霉素溶液的濾紙條與劃線交叉故置,37C孵育24h.如濾紙條周圍細(xì)菌生長正常。說明試驗(yàn)菌株具有R因子。
5.4.5四環(huán)索(PAQI)抗性的鑒定
