1. 生產(chǎn)工藝流程

1.1 施工期工藝流程

本項(xiàng)目位于某地區(qū)，施工期為基礎(chǔ)工程、主體工程、安裝工程和裝修工程。施工期工藝流程圖詳見圖1。

圖1 施工期工藝流程及產(chǎn)污環(huán)節(jié)圖

項(xiàng)目主要工程為基礎(chǔ)工程（平整土地、地基開挖）、主體工程（建筑施工）、裝飾工程（建筑裝修、改造）、設(shè)備安裝及工程驗(yàn)收等。土石方階段、結(jié)構(gòu)階段和裝修階段會產(chǎn)生噪聲；施工、運(yùn)輸車輛、材料裝卸及地表開挖會產(chǎn)生揚(yáng)塵；施工過程及施工人員會產(chǎn)生少量廢水；施工建設(shè)會產(chǎn)生建筑垃圾和施工人員的生活垃圾。

1.2 動物籠具清洗及滅菌流程

動物籠具每周進(jìn)行一次滅菌和清洗，先采用脈動真空壓力蒸汽滅菌器和生物安全滅菌器進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，完成滅菌后在洗消間內(nèi)使用快速籠盒進(jìn)行清洗。該過程會產(chǎn)生廢墊料、廢棄一次性實(shí)驗(yàn)用品、廢包裝物、籠具清洗廢水、動物臭氣。

滅菌原理是以飽和水蒸氣作為滅菌介質(zhì)，采用機(jī)械強(qiáng)制脈動真空的空氣排出方式，經(jīng)3-4次抽真空、注入蒸汽交替作用將內(nèi)室空氣強(qiáng)制排空，使空氣排除量達(dá)到99%以上，徹底消除滅菌室內(nèi)的冷點(diǎn)，完全排除溫度“死角”，在高溫和高壓力的作用下使病原微生物蛋白質(zhì)變性凝固、滅活從而達(dá)到滅菌的目的。

1.3 Shank3實(shí)驗(yàn)流程

Shank3實(shí)驗(yàn)流程圖如下：

圖2 Shank3實(shí)驗(yàn)流程圖

（一）sgRNA設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建

1. 靶點(diǎn)選擇：根據(jù)Shank3（如家犬Shank3外顯子18-22區(qū)段）序列，利用生物信息學(xué)工具（如CRISPRscan、CHOPCHOP）設(shè)計(jì)特異性sgRNA靶點(diǎn)。優(yōu)先選擇外顯子中高度保守且可能導(dǎo)致移碼突變的區(qū)域。
2. 載體構(gòu)建：CRISPR/Cas9質(zhì)粒系統(tǒng)，將sgRNA與Cas9蛋白表達(dá)元件整合至pX330載體，通過T7E1酶切驗(yàn)證sgRNA活性。該步驟在湖北大學(xué)武昌校區(qū)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，不在本項(xiàng)目評價(jià)范圍，本項(xiàng)目主要使用其CRISPR/Cas9混合液成品。

（二）胚胎顯微注射與動物繁殖

1. 家犬模型制備：供體胚胎獲取，對雌性家犬進(jìn)行超排卵處理，采集成熟卵母細(xì)胞與精子體外受精，獲得受精卵。顯微注射，使用顯微操作儀將CRISPR/Cas9混合液（含sgRNA、Cas9mRNA及單鏈DNA修復(fù)模板）注入受精卵原核。胚胎移植，將編輯后的胚胎移植至代孕母犬子宮，妊娠期約63天后分娩。
2. 小鼠模型制備：受精卵采集，對C57BL/6小鼠進(jìn)行超排卵后取卵，與野生型雄性交配獲取受精卵。電穿孔遞送，采用CRISPR電穿孔技術(shù)將Cas9/sgRNA核糖核蛋白復(fù)合體（RNP）導(dǎo)入受精卵，減少脫靶效應(yīng)。假孕母鼠移植，將胚胎移植至假孕母鼠，約21天后獲得F0代嵌合體小鼠。

（三）驗(yàn)證與品系建立

1. 初篩與測序：將PCR產(chǎn)物送測序，通過比對野生型序列確認(rèn)插入/缺失突變（Indel）。家犬需額外進(jìn)行TA克隆測序以排除嵌合現(xiàn)象。
2. 蛋白表達(dá)驗(yàn)證：Western Blot，取動物前額葉皮層組織裂解液，使用Shank3特異性抗體檢測蛋白表達(dá)水平，確認(rèn)突變導(dǎo)致蛋白截短或缺失。
3. 穩(wěn)定品系繁育：家犬，篩選雜合突變個體（F0）與野生型回交，獲得F1代雜合子，再通過兄妹交配獲得純合突變體（F2）。小鼠，直接篩選F0代生殖系傳遞陽性個體，建立純合子品系。

（四）表型分析與模型驗(yàn)證

1. 行為學(xué)評估：三箱社交實(shí)驗(yàn)，將Shank3體與野生型對照置于三箱裝置，量化其對陌生小鼠/家犬的探索時(shí)間，評估社交互動缺陷。自我梳理與埋珠實(shí)驗(yàn)，記錄30分鐘內(nèi)梳理次數(shù)或埋珠數(shù)量，檢測重復(fù)刻板行為。
2. 神經(jīng)電生理檢測：離體腦片記錄，取前額葉皮層或紋狀體腦片，通過膜片鉗技術(shù)檢測突觸傳遞長時(shí)程增強(qiáng)（LTP）變化，評估突觸可塑性損傷。
3. 跨物種腦功能同步分析：人-犬腦電同步，利用EEG記錄人類與Shank3家犬互動時(shí)的腦電信號，計(jì)算θ波（4-8Hz）相位同步指數(shù)，揭示社會認(rèn)知神經(jīng)耦合異常。

（五）安全性評估與倫理審查：脫靶效應(yīng)檢測，全基因組測序（WGS）分析潛在脫靶位點(diǎn)，篩選非預(yù)期突變。動物福利審查，實(shí)驗(yàn)方案需通過動物倫理委員會審批，確保符合《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》。

1.4 治療實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模哼f送修復(fù)Shank3或調(diào)控下游通路，探索自閉癥治療新策略。

1. 治療載體構(gòu)建：設(shè)計(jì)Shank3cDNA過表達(dá)AAV載體（血清型AAV9穿透血腦屏障）。
2. 顱內(nèi)或全身給藥：通過立體定位注射將載體遞送至幼年家犬/小鼠腦區(qū)（如前額葉），或靜脈注射利用PHP.B載體實(shí)現(xiàn)全身遞送。
3. 療效評估
1. 活體腦結(jié)構(gòu)掃描：使用7T高場強(qiáng)MRI掃描儀，對麻醉家犬/小鼠進(jìn)行T1/T2加權(quán)成像，分析皮層厚度、海馬體積等結(jié)構(gòu)變化。
2. 功能連接分析：靜息態(tài)fMRI，檢測默認(rèn)網(wǎng)絡(luò)、突顯網(wǎng)絡(luò)等功能連接強(qiáng)度，定位異常腦區(qū)（如扣帶回、島葉）。任務(wù)態(tài)fMRI，結(jié)合社交刺激（如同類面部圖像），觀察前額葉-杏仁核激活模式。
3. 多模態(tài)數(shù)據(jù)整合：將MRI數(shù)據(jù)與基因表達(dá)譜、行為學(xué)結(jié)果關(guān)聯(lián)，構(gòu)建“基因-腦環(huán)路-行為”多維模型。

1.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處理

項(xiàng)目使用蒸汽滅菌器和生物安全滅菌器進(jìn)行滅菌工作，其滅菌原理是以飽和水蒸氣作為滅菌介質(zhì)，采用機(jī)械強(qiáng)制脈動真空的空氣排出方式，經(jīng)3-4次抽真空、注入蒸汽交替作用將內(nèi)室空氣強(qiáng)制排空，使空氣排除量達(dá)到99%以上，徹底消除滅菌室內(nèi)的冷點(diǎn)，完全排除溫度“死角”，在高溫和高壓力的作用下使病原微生物蛋白質(zhì)變性凝固、滅活從而達(dá)到滅菌的目的。

2. 生產(chǎn)設(shè)備

本項(xiàng)目完成后全廠主要生產(chǎn)設(shè)備詳見下表。